货号：PG0101
存储条件：-20°C至少 12 个月内不影响使用效果。
产品简介：
本品采用了先进的Directional Topoisomerase Cloning（定向拓扑异构酶克隆技术）可以在5min内将待表达目的基因（高保真酶扩增的平末端片段）一步法定向克隆到Gateway入门载体（entry vector），得到的入门克隆（entry clone）可以和各种Gateway目的载体（destination vector）通过LR重组反应，生成表达克隆（expression clone）。方便目的基因在原核/哺乳动物细胞/酵母/昆虫表达系统切换表达。
产品特点：
简单快速，加入待表达基因片段室温仅需5min便可完成入门克隆构建。
定向克隆技术，超过90%插入为正确方向插入，减少克隆筛选耗费的时间。
本载体不含原核表达Shine-Dalgarno(SD)序列，构建原核表达克隆时应选择带SD序列的目的载体进行LR重组。也可在设计的时候，在目的片段前自带SD序列。
测序可以采用 M13F/M13R 通用引物测序（见后面图谱）
操作步骤：
1. 待表达目的基因扩增引物设计原则：
(1) 为了达到定向克隆的目的，上游引物 5’端应该加上额外的 4 个碱基 CACC，这样PCR 产物的 5’端可以和载体上突出的 GTGG 互补配对，从而达到定向克隆的目的。
例如：
待表达序列：5′-ATG GGA TCT GAT AAA ...
设计上游引物：5′-CACC ATG GGA TCT GAT AAA ...
(2) 如果不计划和载体 C 端融合表达，则下游引物的起始端应该加上终止密码子（密码子序列应该为反向互补序列，例如终止密码子是 TGA，那么下游引物起始为 TCA）
(3) 如计划和载体 C 端融合表达，则下游引物的起始端应该不包含终止密码子；为达到定向克隆的目的，下游引物 5’起始应该不包含 CACC，这样可以避免 PCR 产物的3’端也可以和载体上突出的 GTGG 互补配对而造成错误方向的插入。
2. 连接反应的准备：
PCR引物不能磷酸化。使用扩增产物是平末端的高保真聚合酶系列扩增（如Pfu、Vent、Kod、 Phusion DNA Polymerase）。PCR产物建议胶回收纯化。
3. 连接反应：
1) 室温（20℃-30℃）按照如下体系操作（10ul 体系）：
纯化后的PCR 产物 | 0.5-8ul |
pTOPO-ENTR/D Vector | 1ul |
10 ´ Enhancer | 1ul |
灭菌水 | Xul |
总体积 | 10ul |
加完试剂后，用移液器轻轻吹打混匀或者轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体在离心管底，注意此步骤不能在冰上进行，只能在室温（20℃-30℃）进行。
不同大小插入片段的推荐用量：
插入片段大小（bp） | 最佳用量（ng） |
100-1000 | 20-40 |
1000-2000 | 30-70 |
2000-5000 | 40-100 |
2) 室温（20℃-30℃）连接 5 min。
本载体推荐室温 5min完成连接，但在很多情况下连接 2-3 min已经可以得到足够多的转化子。
3) 连接产物可直接转化克隆感受态细胞（如 DH5a，TOP10 等）或贮存于-20℃。如尚未准备好感受态细胞，可以将连接产物短时间置于冰上备用。
4. 转化：
1)50-100ul感受态细胞，置于室温解冻，完全解冻后（约1 min左右）轻掸几次将细胞均匀悬浮。
2)加入5ul连接液(最多可全部加入，只要体积不超过感受态细胞体积的 1/10)，轻轻混匀室温放置 5min。
根据经验，载体使用商品化的感受态细胞不需要冰浴和热休克、室温放置 5 min便可获得足够多转化子，如果实验室自制感受态细胞或者效率较低时，可以按照标准程序进行。
加 300-500ul LB 或者 SOC 培养基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm 振荡培养 60min。一般可以直接将培养基（事先平衡至室温） 加入感受态细胞的 1.5 ml 离心管，盖上离心管盖，水平固定在振荡培养箱中振荡培养复苏即可， 不需要转移到试管培养复苏。
4)取 200ul 菌液涂板，培养过夜（如果预计转化子少，为得到较多克隆，4000 rpm 离心 1 min，吸弃掉部分上清，保留 100-150ul，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板）
5.转化子的筛选鉴定：
1).菌落 PCR 检测/提取质粒内切酶酶切鉴定阳性克隆。
2).用 M13 通用引物测序，来确定是否含有目的克隆。
pTOPO-ENTR/D 载体图谱：
pTOPO-ENTR/D 载体通用测序引
M13F: CTGTAAAACGACGGCCAG
M13R: CAGGAAACAGCTATGAC
