货号：N0035
存储条件：-20℃避光保存
产品组分
组分名称 | 100T |
A. NAD+ /NADH 提取液 | 60 ml |
B. 乙醇脱氢酶 | 220 μL |
C. 显色液 | 1.1 mL |
D. NADH | 5 mg |
E. NADH 配制液 | 0.8 mL |
F. 反应缓冲液 | 10 mL |
产品介绍
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)是所有细胞中都存在的一种辅酶，包括 NAD+(氧化型)和NADH(还原型)两种形式。NAD+既是氧化还原反应过程中传递电子的辅酶，又可以作为很多酶的底物来参与细胞内反应。
NAD+在细胞和体内发挥着重要的功能，其合成和降解及其产物参与细胞凋亡、代谢调控和基因表达的调控等，并且 NAD+的减少是细胞死亡的主要因素之一。NAD+在调节细胞氧化还原状态方面的重要性以及调控信号通路及转录方面的功能，使得 NAD+及其合成和消耗的酶成为多种疾病的潜在药物靶点。传统的 NAD+/NADH 和 NADP+/NADPH 测定是通过检测 340nm 处的吸收来完成的，该方法灵敏度低且易受干扰。NAD/NADH 检测试剂盒是一种基于 WST-8 的显色反应，通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中NAD+(氧化型辅酶Ⅰ)和NADH(还原型辅酶Ⅰ)各自的量、比值和总量的检测试剂盒。NAD/NADH检测试剂盒能特异性地检测 NAD+和 NADH，而不检测 NADP+和 NADPH，在反应过程中 NAD+被还原为 NADH，NADH 将WST-8 还原成橙黄色 formazan（甲臜），在 450 nm 左右有最大吸收峰。反应体系中生成的 formazan 与样品中 NAD+或 NADH的总量呈比例关系。本试剂盒可检测 0.1 μM-10 μM NAD+或 NADH。
使用方法
1. 样品准备
细胞样品（贴壁细胞或悬浮细胞）：收集约 1×106 个细胞，离心去除培养液，用预冷的 PBS 清洗细胞，离心 5 min，弃上清，加入 200 μL 冰浴预冷的 NAD+/NADH 提取液，轻轻吹打以促进细胞的裂解，裂解过程在室温或冰上操作均可。裂解结束后 12,000 g，4ºC 离心 5-10 min，取上清备用。
组织样品：冰上预冷的 PBS 清洗组织后，称取样品 10-30 mg，用剪刀剪碎，置于匀浆器中，加入 400 μL NAD+/NADH 提取液于室温下或冰上进行匀浆，结束后 12,000 g，4℃离心 5-10 min，取上清备用。
2. 实验准备
（1）配制 10 mM NADH 标品：吸取655 uL NADH配制液，充分溶解试剂盒提供的5mg NADH后即得到10mM NADH标准品，适当分装后-80℃避光保存。
（2）稀释标品：将10 mM的 NADH 标品用 NAD+/NADH提取液 稀释成合适的浓度梯度，如 0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10 μM，向 96 孔板中每孔加入20 μL的标准品。如有需要，可根据样品中 NADH 的含量适当调整标品浓度范围。其中浓度为0μM的点为空白对照点，仅含NAD+/NADH提取液。
注：由于NADH很不稳定，故配制后需尽快使用。
（3）乙醇脱氢酶工作液的配制（现用现配）：用反应缓冲液将乙醇脱氢酶稀释45倍。例如2uL乙醇脱氢酶加入到88uL的反应缓冲液中，即可获得90uL的乙醇脱氢酶工作液。检测时，向每个标品或样品中加入90 μL 乙醇脱氢酶工作液。
3. 样品测定
（1）NAD+/NADH 总量测定：吸取 20 μL 待测样品于 96 孔板中，设置重复。如样品中的 NAD+或 NADH 含量过高，超出标准曲线的范围，则需用 NADH 配制液适当稀释后再进行检测，含量过低时应增加样品的用量。
（2）样品中 NAD+、NADH 含量或 NAD+/NADH 比值的测定：向离心管中加入50-100μL 待测样品，60℃加热 30 min 以分解 NAD+，如果加热后产生不溶物，10000 g，室温或 4℃离心 5 min，吸取 20μL 上清至 96 孔板中待测，设置重复。如样品中的 NAD+或 NADH 含量过高，超出标准曲线的范围，则需用NADH配制液适当稀释后再进行检测，含量过低时应增加样品的用量。
（3）在 96 孔板中按照如下方式加样：
空白对照 | 标准品 | 样品 | |
待测样品 | - | 20 μL | 20 μL |
NADH 配制液 | 20 μL | - | - |
乙醇脱氢酶工作液 | 90 μL | 90 μL | 90 μL |
（4）37℃避光孵育10分钟。
注：此孵育步骤的目的是将样品中的NAD+转化为NADH；在加入乙醇脱氢酶工作液的过程中须轻柔操作，以免产生气泡。若不慎出现气泡，可使用细小的吸头或针头戳破。
（5）每孔加入 10 μL 显色液，充分混匀后，室温孵育 30 min，测 450 nm 处的吸光度。
（6）数据分析。根据标准曲线计算样品中的 NAD+和 NADH 总浓度或 NADH 的浓度，通过样品加入的体积即可计算出 NAD+、NADH、NAD+/NADH 总量。
a. 计算标准品组中每个点的平均吸光度，减去空白对照组的吸光度，即为各个标准品的吸光度。
b. 以NADH的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。
c. 根据标准曲线计算细胞、组织等样品中的NAD+和NADH总浓度或者NADH的浓度。未60℃加热处理时，检测得到的是样品中NAD+和NADH总量的浓度(NADtotal)；60℃加热处理后，检测得到的是样品中NADH的浓度。
注：根据检测得到的浓度及样品的体积，即可计算出NAD+、NADH、NADtotal的量。
d. 根据如下计算公式，计算样品中NAD+的量以及NAD+/NADH的比值。此时可以把NAD+和NADH总量或各自的含量用单位细胞数量或单位组织重量中的含量来表示。
[NAD+] = [NADtotal] - [NADH]
[NAD+]/[NADH] = ([NADtotal] - [NADH])/[NADH]
e. 如果希望更加精确地来表述NAD+和NADH总量或各自的含量，可以将样品用BCA法测定蛋白浓度。最终用单位蛋白量中NAD+和NADH总量或各自的含量来比较精确地进行表述。
注意事项
1. 建议 NADH 标准品溶解后小量分装保存，避免反复冻融。
2. NAD+/NADH 提取液粘稠，使用过程中务必保证和待加入的体系充分混匀。
3. 加样和混匀过程中，应避免产生气泡影响最终的吸光度检测。
4. 由于 NAD+/NADH 不稳定，易降解，所以尽量使用新鲜样品进行检测。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
说明书下载
