产品货号：N0036

储存温度：−20℃干燥避光 

产品描述

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP)是很多氧化还原反应的辅酶，包括 NADP + (氧化型)和 NADPH(还原型)两种形式。NADP + 也参与到生物合成反应中，比如脂质和核酸的合成。传统的NAD+ /NADH 和 NADP+ /NADPH 测定是通过检测 340 nm 处的吸收来完成的 ， 该方法灵敏度低 且 易受干扰 。

NADP/NADPH 检测试剂盒是一种基于 WST-8 的显色反应，通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中 NADP + (氧化型辅酶Ⅰ)和 NADPH(还原型辅酶Ⅰ)各自的量、比值和总量的检测试剂盒。NADP/NADPH 检测试剂盒能特异性地检测NADP +和 NADPH，而不检测 NAD+和 NADH，在反应过程中 NADP +被还原为 NADPH，NADPH 将 WST-8 还原成橙黄色 formazan（甲臜），在 450 nm 左右有最大吸收峰。反应体系中生成的 formazan 与样品中 NADP +或 NADPH 的总量呈比例关系。本试剂盒可检测 0.1 μM-10 μM NADP +或NADPH。

使用方法

1. 样品准备

细胞样品（贴壁细胞或悬浮细胞）：收集约 1×106 个细胞，离心去除培养液，用预冷的 PBS 清洗细胞，离心 5 min，弃上清，加入 200 μL 冰浴预冷的 NADP + /NADPH 提取液，轻轻吹打以促进细胞的裂解，裂解过程在室温或冰上操作均可。裂解结束后 12,000 g，4ºC 离心 5-10 min，取上清备用。组织样品：冰上预冷的 PBS 清洗组织后，称取样品 10-30mg ， 用剪刀剪碎 ， 置于匀浆器中 ，加入400μLNADP + /NADPH提取液于室温下或冰上进行匀浆，结束后12,000 g，4ºC 离心 5-10 min，取上清备用。

2. 实验准备

（1）配制 10 mM NADPH 标品：先将 10× NADPH 配制液先用水稀释为 1×NADPH 配制液。再吸取 600 μL 1×NADPH配制液加入 D 组分所在的管中，充分溶解，得到 10 mM NADPH 标品溶液，适当分装后置于-80℃冰箱，避光保存。

（2）稀释标品：将 10 mM 的 NADPH 标品用 NADPH 配制液稀释成合适的浓度梯度，如 0、0.25、0.5、1、2、4、

6、8、10 μM，向 96 孔板中每孔加入 50 μL 的标准品。如有需要，可根据样品中 NADPH 的含量适当调整标品浓度范围。

（3）G6PDH 酶工作液的配制（现用现配）：用反应缓冲液将 G6PDH 酶稀释 50 倍。检测时，向每个标品或样品中加入 100 μL G6PDH 酶工作液。

3. 样品测定

（1）NADP + /NADPH 总量测定：吸取 50 μL 待测样品于 96孔板中，设置重复。如样品中的 NADP +或 NADPH 含量过高，超出标准曲线的范围，则需用 NADPH 配制液适当稀释后再进行检测，含量过低时应增加样品的用量。

（2）样品中 NADP +、NADPH 含量或 NADP + /NADPH 比值的测定：向离心管中加入 100-200 μL 待测样品，60℃加热30 min 以分解 NADP +，如果加热后产生不溶物，10000 g，室温或 4℃离心 5 min，吸取 50 μL 上清至 96 孔

板中待测，设置重复。如样品中的 NADP +或 NADPH含量过高，超出标准曲线的范围，则需用 NADPH 配制液适当稀释后再进行检测，含量过低时应增加样品的用量。

（3）在 96 孔板中按照如下方式加样：

（4）每孔加入 10 μL 显色液，充分混匀后，室温孵育 10-15min，测 450 nm 处的吸光度。

（5）数据分析。根据标准曲线计算样品中的 NADP +和NADPH 总浓度或 NADPH 的浓度，通过样品加入的体积即可计算出 NADP +、NADPH、NADP + /NADPH 总量。

注意事项

1. 建议 NADPH 标准品溶解后小量分装保存，避免反复冻融。

2. NADP + /NADPH 提取液粘稠，使用过程中务必保证和待加入的体系充分混匀。

3. 加样和混匀过程中，应避免产生气泡影响最终的吸光度检测。

4. 由于 NADP + /NADPH 不稳定，易降解，所以尽量使用新鲜样品进行检测。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。