产品货号：N0036

储存温度：−20℃干燥避光，有效期一年。NADPH 配制成溶液后，须适当分装后-80℃保存。所有试剂避免反复冻融。

产品描述

NADP+/NADPH 检测试剂盒(WST-8 法) (NADP+/NADPH Assay Kit with WST-8)是一种基于 WST-8 的显色反应，通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中 NADP+ (氧化型辅酶 II)和 NADPH (还原型辅酶 II)各自的量、比值和总量的检测试剂盒。

NADP+/NADPH 以及 NAD+/NADH 的传统检测方法是检测NADPH 或者 NADH 在 340nm 处吸收波长的变化 ，该方法灵敏度较 低并易受样品中有类似紫外吸收物质的干扰，并且在紫外检测过程中通常需要加大检测样品量以弥补 NADPH 在 340nm 处吸光度过小的不足，因此该检测方法具有很大的局限性。

WST-8 是 MTT 的一种升级替代产品。WST-8 产生的 formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。并且 WST-8 产生 formazan比 XTT 和 MTS 产生的 formazan 更易溶解。再次 ，WST-8 比 XTT 和MTS 更加稳定 ，使实验结果更加稳定。另外 ，WST-8 和 MTT、XTT、 WST-1等相比 ，线性范围更宽 ，灵敏度更高。

本试剂盒使用便捷 ，无需分离纯化细胞、组织或其它样品中的NADP+和 NADPH ，且特异性检测 NADP+和 NADPH ，而不检测NAD+和 NADH。本试剂盒可以检测含量低至 0.05μM (2.5pmol)的NADP+或 NADPH，在 0.05μM (2.5pmol)至 6μM (300pmol)之间呈现良好的线性关系。

NADP (Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)是很多氧化还原反应的辅酶 ，包括 NADP+(氧化型)和 NADPH (还原型)两种形式。NADP+也参与到生物合成反应中，比如脂质和核酸的合成。在动物细胞中 ，戊糖磷酸途径(pentose   phosphate pathway ， PPP)的氧化阶段是 NADPH 最主要的来源。

本试剂盒可检测样品中的 NADP+、NADPH 以及它们的比值，具体原理如下：

1） 测定 NADP+/NADPH 的总量：葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phos phate, G6P)在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydr ogenase, G6PDH)的作用下氧化生成 6-磷酸葡萄糖酸内酯(6-phosph ogluconate,6-PG)，在这一反应过程中 NADP+被还原为 NADPH；生成的 NADPH 在电子耦合试剂的作用下将 WST-8 还原生成橙黄色的formazan ，在 450nm 左右检测有最大吸收峰。反应体系中生成的for mazan 与样品中总的 NADP+/NADPH 的总量呈比例关系。WST-8 法检测 NADP+和 NADPH 总量的原理参考图 1。

2）单独测定 NADPH 的量： 60℃水浴加热 30 分钟后 ，样品中NADP+会分解而只保留 NADPH。 NADPH 将 WST-8 还原成

formazan ，通过比色法确定反应生成的formazan 的量 ，最终可以确定样品中 NADPH 的量。

3） 测定 NADP+以及 NADP+/NADPH 比值：根据前两步检测获得的 NADP+和 NADPH 总量以及 NADPH 的量 ，即可得到样品中

NADP+的量以及 NADP+/NADPH 的比值。

使用方法

1.样品准备

细胞样品（贴壁细胞或悬浮细胞） ：收集约 1 × 106 个细胞 ，离心去除培养液 ，用预冷的 PBS 清洗细胞 ，离心 5min ，弃上清 ，加入 200μL冰浴预冷的 NADP+/NADPH 提取液 ，轻轻吹打以促进细胞的裂解，

裂解过程在室温或冰上操作均可。裂解结束后 12,000g，4ºC 离心 5-10min ，取上清备用。

组织样品：冰上预冷的 PBS 清洗组织后，称取样品 10-30mg ，用剪刀剪碎，置于匀浆器中，加入 400μLNADP+/NADPH 提取液于室温下或冰上进行匀浆 ，结束后 12,000g ，4ºC 离心 5-10min ，取上清备用。 

2.实验准备

（1）配制 1mM  NADPH 标品：吸取 6ml 超纯水充分溶解本试剂盒提供的 5mg  NADPH 后即得到 1mM  NADPH 标准品。1mM  NADPH标准品请适当分装后-80℃避光保存。

（2）NADPH 标准曲线的设置：把 1mM 的 NADPH 标准品用 NADP +/NADPH 提取液稀释成适当的浓度梯度，如初次检测可以设置 0、0.

25、0.5、1、2、4、6、8μM 这几个浓度，检测时 96 孔板每孔加入 5 0uL 的标准品，相当于每孔为 0、12.5、25、50、100、200、300、4 00pmol 的 NADPH。如有必要，在后续的实验中可以根据样品中的 N ADPH 含量对标准品的浓度范围进行适当调整。其中浓度为 0uM 的点为空白对照点，仅含 NADP+/NADPH 提取液。

注意： 由于 NADPH 很不稳定，故配制后需尽快使用。

（3）G6PDH 酶工作液的配制（现用现配）：用反应缓冲液将 G6PDH酶稀释 50 倍。例如 2uL G6PDH 加入到 98uL 的反应缓冲液中，即可获得 100uL 的 G6PDH 工作液。检测时，向每个标品或样品中加入 10 0μLG6PDH 酶工作液。

3.样品测定

（1） NADP+/NADPH 总量测定：吸取 50μL 待测样品于 96 孔板中，设置重复（减少误差）。如样品中的 NADP+或 NADPH 含量过高，超出标准曲线的范围，则需用NADP +/NADPH 提取液适当稀释后再进行检测，含量过低时需要加大细胞或组织样品的用量。

（2）样品中 NADP+、NADPH 含量或 NADP+/NADPH 比值的测定：向离心管中加入 100-200μL 待测样品，60℃水浴或者 PCR 仪上加热 3 0min 以分解 NADP+，如果加热后产生不溶物，10,000g，室温或 4℃离心 5min，吸取 50μL 上清至 96 孔板中待测，设置重复。如样品中的NADP+或 NADPH 含量过高，超出标准曲线的范围，则需用 NADP + /NADPH 提取液适当稀释后再进行检测，含量过低时需要加大细胞或组织样品的用量。

（3）在 96 孔板中按照如下方式加样：

（4） 37℃避光孵育 10 分钟。说明 ：此孵育步骤的目的是将样品中的NADP+转化为 NADPH；在加入 G6PDH 工作液过程中须轻柔操作，以免产生气泡。若不慎出现气泡 ，可使用细小的吸头或针头戳破。

（5）适当混匀显色液 ，然后每孔加入 10uL 显色液 ，混匀 ，37℃避光孵育 10-20 分钟 ，此时会形成橙黄色的 formazan。测量 450nm 处的吸光度。如果显色较浅 ，也可以适当延长孵育时间至 30-60 分钟 ，随着孵育时间延长 ，显色会逐渐加深。

4. 样品中 NADP+/NADPH 量的计算：

（1）计算标准品组中每个点的平均吸光度，减去空白对照组的吸光度，即为各个标准品的吸光度。

（2）以 NADPH 的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。 NADPH 标准品的检测效果请参考图 2。如果孵育时间过长 ，高浓度标准品的显色会达到平台，此时宜选择未达到平台的标准品来绘制标准曲线 ，或者选择孵育时间较短的标准品吸光度数据来绘制标准曲线。

图 2.  NADPH 的标准曲线。上图显示本试剂盒可以很好地检测出 NADPH 的含量，并且不会受 NADH 的干扰。不同的检测条件下 ，实际读数会因标准品的配制、检测仪器等的不同而存在差异 ，图中数据仅供参考。

（3）根据标准曲线计算细胞、组织等样品中的 NADP+和 NADPH 总浓度或者 NADPH 的浓度。未 60℃加热处理时 ，计算得到的是样品中NADP+和 NADPH 总量的浓度(NADP total)；60℃加热处理后 ，检测得到的是样品中 NADPH 的浓度。

备注 ：根据检测得到的浓度及样品的体积 ，即可计算出 NADP+、 NA DPH、 NADPtotal 的量。

（4）根据如下计算公式，计算样品中 NADP+的量以及 NADP+/NAD PH 的比值。此时可以把 NADP+和 NADPH 总量或各自的含量用单位细胞数量或单位组织重量中的含量来表示。

[NADP+]  =  [NADP total]  -  [NADPH]

[NADP+]/[NADPH]  =  ([NADP total]  -  [NADPH])/[NADPH]

（5）如果希望更加精确地来表述 NADP+和 NADPH 总量或各自的含量 ，可以将样品用 BCA 法测定蛋白浓度。最终用单位蛋白量中 NADP +和 NADPH 总量或各自的含量来比较精确地进行表述。 

注意事项

1)试剂盒中所有组份均要冷冻保存。如果不是一次用完，为避免反复冻融导致产品失效 ，请适当分装后保存。

2) NADPH 不稳定 ，取出 NADPH 后请尽快使用。如果发现标准曲线不理想 ，很有可能是标准品发生了降解。

3）由于 NADP+/NADPH 提取液本身比较粘稠 ，以该提取液作为稀释液时，无论对标准品还是样品进行稀释，在稀释过程中务必保证稀释均匀 ，否则易造成实验数据产生较大波动。

4）在样品加样和混匀过程中 ，须尽量避免产生气泡 ，以免影响最终的吸光度测定。

5）如果不能非常严格地控制反应温度和反应时间 ，每次检测都需要设置标准曲线。

6）如果样品溶液中 NADP+和 NADPH 浓度过高或过低 ，不在试剂盒的线性检测范围内时 ，可适当调整样品或者提取液的用量。

7） 由于 NADP+和 NADPH 很不稳定 ，在冻存过程中较易降解 ，所以宜尽量使用新鲜样品进行检测。

8）本公司所有产品仅限于专业人员用于生命科学研究 ，不得用于临床诊断或治疗 ，不得用于食品或药品 ，不得存放于普通住宅。

9)本公司所有产品必须由合格专业技术人员操作同时佩戴口罩/手套/实验服并遵守生物实验室安全操作规程！