货号：LT0201

储存温度：-20℃，浓度5U/ul。

产品组成、浓度

产品介绍

一般PCR法具有一定的局限性，特别是难以扩增5kb以上的长链DNA，这严重限制了PCR法的推广和应用。通过改变PCR用DNA聚合酶、PCR用Buffer、PCR扩增条件等，使长链DNA的扩增成为可能，这就是LA（Long and Accurate）PCR技术。本试剂盒所用的Long Taq是Taq聚合酶和有矫正作用的聚合酶的混合物，这种聚合酶可以染色体和其他细胞器的DNA为模板高效进行PCR反应。在人的染色体上可以扩增长度可达27kb的DNA片段，而以λDNA为模板则可扩增出高达40kb的片段。

适用范围

一般用于DNA片段的PCR扩增、DNA标记、引物延伸、序列测定、DNA平末端加A等，产物可直接用于TA克隆。

体系配置（建议）

建议循环条件

*扩增大片段尤其是20kb以上的片段建议15-30个循环，每个循环的延伸时间要增加10-15sec“自动延伸”时间，如果PCR仪器没有“自动延时”功能，那么设定延伸时间建议在原有基础上增加1-4min。

注意事项：

1.10x Long Taq Buffer pH值较高，可能会形成【Mg(OH)2】沉淀，使用蒨要充分溶解，并用Votex保证可能的沉淀重新溶解，或者37℃温育5min，然后Votex充分混匀。

2. 扩增长片段建议使用0.2ul薄壁管。其他试管未经测试。较厚的试管在92℃时不能有效的使模板变性。变性时，尽可能缩短变性时间，降低变性温度。第一步变性在92℃-94℃下进行2min（GC含量高可能延长时间达5min）。再循环过程中尽可能缩短变性时间（92℃-94℃下进行10-15s），除非模板中富含GC，则95℃下变性30s，这可以防止DNA脱嘌呤和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段中长度超过12kb时，应尽可能降低变性温度和时间。变性需要的时间在不同PCR仪上稍有不同。

3. 如果扩增片段GC含量高或者扩增片段比较长，可在反应混合物中加入DMSO到终浓度1%-8%，最常用2%（小于30kb）或者4%（大于30kb）往往会改善扩增效果。

4. 扩增长片段，引物一般终浓度为0.3-1uM，长度最好为27-36bp；退火温度一般在65℃-70℃，此时退火温度和延伸温度基本一致，可将退火延伸在一个温度进行，使用2阶段扩增法。当然如果设计的引物在20bp左右，则还是使用传统3阶段扩增法。

5. 模板一般使用0.01-2.5ng(λ phage)或者0.1-1ug（human）。

6. 1xLong Taq buffer中Mg2+浓度为2.5mM，建议dNTP浓度为400mM，要得到最佳结果，优化Mg2+是必须的。如果含有较高的EDTA或螯合剂，则应该提高Mg2+；如果要增加dNTP浓度，相应的也要增加Mg2+浓度。