货号：P1052

储存条件：蛋白酶抑制剂 -20℃保存，其他组分均保存在4℃。

有效期：2年

产品组分

产品简介

本试剂盒采用 GST 标签纯化树脂来高效完成 GST 标签融合蛋白的体外 pull-down 实验。实验前先将目标基因连入带有 GST 标签的原核表达载体中，在大肠杆菌中表达出 GST 融合蛋白。利用 GST 标签纯化树脂与 GST 标签的强亲和性，纯化 GST 融合蛋白，再与样本裂解液孵育，样本中的互作蛋白即可被吸附而分离。

注意事项

请勿干燥或冷冻树脂，这些操作会导致树脂聚集而降低结合能力。

由于煮沸会导致树脂聚集并且失去结合能力，经煮沸的树脂不应再次使用。

裂解缓冲液可兼容 BCA 蛋白定量。

洗脱缓冲液为强酸性，最终的洗脱产物中含有 GST 融合蛋白及其互作蛋白。

自备材料：

表达 GST-诱饵蛋白的大肠杆菌、PBS。

所需仪器：低温离心机、混匀仪、超声仪（动物组织、植物和微生物样本裂解需要）。

操作方法

注：

1）请在吸取树脂时，将移液枪枪头尖部剪掉 1~2mm。

2）为保证树脂均匀分布，请通过反复颠倒、轻微涡旋彻底混匀瓶中树脂。

3）具体样品量和孵育时间依赖于每个特定体系，因而可能需要优化才能得到最大产量。

4）实验前需要先做 western blot 实验确定 GST 融合蛋白和待测互作蛋白是否可溶表达。

1. GST-诱饵蛋白制备

(1) 离心收集已诱导表达可溶诱饵蛋白的大肠杆菌菌体沉淀约 50 μL，加入 1 mL 预冷的 PBS，吹打混匀； 4℃ 5000 g 离心 5 min，去除上清；重复该漂洗操作两次；

(2) 向菌体中加入 300~500 μL 预冷的裂解液、3~5 μL 蛋白酶抑制剂（按 1:100 添加），吹打混匀，超声破碎至溶液基本澄清。

(3) 4 ℃ 12000 g 离心 15 min，收集上清至新的离心管中，取 30 μL 作为 bait-input，剩余用于 pull-down 实验，- 80℃保存。

2. 待测蛋白制备

(1) 待测样本的收集和处理：动物细胞建议使用1×107 ~ 2×107个，冷 PBS 漂洗 2~3 次，彻底去除培养基成分，4℃ 500 g 离心 5 min 收集沉淀；动物组织，建议100~200 mg，冷 PBS 或生理盐水清洗干净，彻底去除血液等成分，液氮充分研磨；植物组织，建议200~300 mg，无菌双蒸水清洗干净，液氮充分研磨；原核表达菌，取50 μL 菌体沉淀，冷 PBS 漂洗 2~3 次，彻底去除培养基成分，4 ℃ 5000 g 离心 5 min 收集沉淀。

(2) 样本加入 300~500 μL 预冷的裂解液、3~5 μL 蛋白酶抑制剂（按 1:100 添加），吹打混匀。

(3) a. 动物细胞：置于冰上裂解 30 min（间隔手动混匀）；为了更充分裂解，也可以冰上超声至溶液基本澄清。

b. 动物组织：最好冰上超声破碎至溶液基本澄清，也可以置于冰上裂解 30 min（间隔手动混匀）。

c. 植物、原核表达菌：冰上超声破碎至溶液基本澄清。

(4) 4 ℃ 12000 g 离心 15 min，收集上清至新的离心管中，取 30 μL 作为 prey-input，剩余用于 pull-down 实验，- 80℃保存。

注：当样本不能完全裂解时（溶液很浑浊），可以适当增加裂解液的用量继续裂解。如果样本中目标蛋白丰度较低，或目标蛋白间结合较弱，也可以增加初始样本量；300 μL 为裂解缓冲液的最小使用体积，当样本增加时，裂解液缓冲液可等比例增加，但总孵育体积最大不超过离心管体积的 2/3。超声条件因样本类型和超声设备而异，可提前摸索好合适的条件。

3.漂洗液准备

取10 mL 离心管（空管），加入本次实验 2 组样本（实验组+对照组）所需的 7 mL 漂洗液、35 μL 蛋白酶抑制剂（按 1:200 添加），混合均匀，冰上保存，现配现用。

注：如果有多组样本，按照实际使用量配置。

4.GST-诱饵蛋白纯化

(1) 每组实验取 50 μL Glutathione Beads 4FF，加入 200 µL 漂洗液（步骤3中 制备），颠倒混匀 30 次， 500 g 离心 5 min，弃上清。

(2) 再次加入 200 µL 漂洗液（3. 制备），颠倒混匀 30 次，500 g 离心 5 min，弃上清。

(3) 向Glutathione Beads 4FF中加入含 GST-诱饵蛋白的大肠杆菌裂解液（步骤1中制备），放混匀仪上 4 ℃孵育 1~2 h。

(4) 4 ℃ 500 g 离心 5 min，弃上清。

(5) 加入 500 μL 漂洗液（步骤3中制备），颠倒混匀 30 次，4 ℃ 500g 离心 5 min，弃上清；重复该漂洗操作两次，得到纯化的 GST-诱饵蛋白树脂。

5. GST pull-down

(1) 向上步树脂中加入待测样本裂解液（步骤2中制备），放混匀仪上室温孵育 3 h 或 4 ℃孵育过夜。

(2) 4 ℃ 500 g 离心 5min，弃上清。

(3) 加入 500 μL 漂洗液（步骤3中制备），颠倒混匀 30 次，4 ℃ 500g 离心 5 min，弃上清；重复该漂洗操作两次。

(4) 加入 50 μL 洗脱液，涡旋震荡 20 s，放混匀仪上室温洗脱 15 min，涡旋震荡 20 s。

(5) 4 ℃ 12000 g 离心 5 min，收集上清至新的离心管中，- 80℃保存，或直接用于 Western-blot、SDS-PAGE 或质谱实验。

注：Pull-down 捕获的蛋白量通常较少，因此 SDS-PAGE 建议用硝酸银染色而非考马斯亮蓝染色，硝酸银染色步骤参考如下（不同厂家的操作方式不同，建议参照对应厂家的建议方式）：

(1) 固定：30 min（乙醇：乙酸：水=4：1：5 体积比）；(2) 敏化：30 min（乙酸钠 10.2 g，硫代硫酸钠 0.471 g，乙醇 45 mL，加水至 150 mL）；(3) 水洗：4 次，每次 10 min；(4) 银染：30 min（硝酸银 0.375 g，加水至 150 mL）；(5) 水洗：2 次，每次 40 s；(6) 显色：显影至条带清楚（碳酸钠 4.5 g，72 μL 甲醛，加水至 180 mL）；(7) 终止：5 min（Na2EDTA 2.19 g，加水至 150 mL）。