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  • M-MLV GIII Reverse Transcriptase(三代酶)(货号:M5124)
  • M-MLV GIII Reverse Transcriptase(三代酶)(货号:M5124)

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CAS:
-


货号M5124

储存条件-20℃

产品组成

组分规格

规格

M-MLVGIII Reverse Transcriptase(200U/ul)

50ul

5×M-MLV First Strand Buffer

500ul

0.1M DTT

100ul


产品简介

M-MLV GIII Reverse Transcriptase是通过基因修饰和重组技术获得的第三代M-MLV逆转录酶。该酶相对于野生型M-MLV逆转录酶去除了RNase H活性,并大幅提高了热稳定性(最适反应温度为50℃),从而大大提高了合成第一链cDNA时的特异性和长度(最长可达12 kb),增强了对RNA复杂二级结构的耐受性。

酶活单位定义

37℃条件下,以Poly(A)-Oligo(dT)为模板/引物,在10 min内, 掺入1 nmol的[3H] dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。

质量控制

宿主原性DNA检测

无宿主DNA污染

核酸内切酶残留检测

将酶液与超螺旋质粒DNA在37℃温育4h,通过DNA电泳检测质粒无变化。

核酸外切酶残留检测

将酶液与双链DNA底物在37℃温育16h,通过DNA电泳检测双链DNA底物无变化

使用方法

质粒载体线性化与去磷酸化同步反应流程

1. 于冰上配制如下反应体系:

试剂

使用量

引物

X ul

Oligo(dT)20

              终浓度2.5uM

或随机引物

             终浓度2.5ng/ul

或基因特异性引物

              终浓度0.25uM

模板 RNAa

50 ng~1ug/20ul

5× M-MLV First Strand Buffer

4ul

0.1 M DTT

1ul

M-MLV GIII Reverse Transcriptase (200 U/ul)

1ul

dNTP Mix (10 mM Each)

1ul

(可选)RNase Inhibitor (40 U/ul)

1ul

Nuclease-Free Water

To 20ul


2. 轻柔吸打混匀后,瞬离;a. 推荐使用试剂盒提取的已去除基因组DNA污染的高质量RNA作为模板。


3. 若使用Oligo(dT)20或基因特异性引物,50℃温育30 min;若使用随机引物,先25℃温育5 min,之后50℃温育30 min;

注:若目的cDNA小于3 kb,温育时间可缩短为15 min。

4. 反应结束后,85℃温育5 min 以终止反应;

5. 将获得的 cDNA 溶液置于冰上,用于后续实验。

注:cDNA 溶液置于 -20℃可保存半年;置于 -80℃可长期储存



试剂

                             使用量

引物

                        X ul

Oligo(dT)20

终浓度2.5uM

或随机引物

 终浓度2.5ng/ul

或基因特异性引物

  终浓度0.25uM

模板 RNAa

                        50 ng~1ug/20ul

5× M-MLV First Strand Buffer

                         4ul

0.1 M DTT

                         1ul

M-MLV GIII Reverse Transcriptase (200 U/ul)

                         1ul

dNTP Mix (10 mM Each)

                         1ul


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