货号： M5124
储存条件： -20℃
产品组成
组分规格 | 规格 |
M-MLVGIII Reverse Transcriptase(200U/ul) | 50ul |
5 ×M-MLV First Strand Buffer | 500ul |
0.1M DTT | 100ul |
产品简介
M-MLV GIII Reverse Transcriptase 是通过基因修饰和重组技术获得的第三代 M-MLV 逆转录酶。该酶相对于野生型 M-MLV 逆转录酶去除了 RNase H 活性，并大幅提高了热稳定性（最适反应温度为 50℃), 从而大大提高了合成第一链cDNA 时的特异性和长度（最长可达 12 kb），增强了对 RNA 复杂二级结构的耐受性。
酶活单位定义：37℃条件下， 以 Poly(A)-Oligo(dT)为模板/引物，在 10min 内掺入 1nmol 的[3 H] dTTP所需要的酶量定义为 1个活性单位（U）。
质量控制
宿主原性 DNA 检测
无宿主 DNA 污染。
核酸内切酶残留检测
将酶液与超螺旋质粒 DNA 在 37℃温育 4h ，通过 DNA 电泳检测质粒无变化。
核酸外切酶残留检测
将酶液与双链 DNA 底物在 37℃温育 16h ，通过 DNA电泳检测双链 DNA 底物无变化。
使用方法
第一链cDNA合成步骤
1. 于冰上配制如下反应体系：
试剂 | 使用量 |
引物 | x μl |
Oligo(dT)20 | 终浓度2.5 μM |
或随机引物 | 终浓度2.5 ng/μl |
或基因特异性引物 | 终浓度0.25 μM |
模板RNAa | 50 ng~1 μg/20 μl |
5× M-MLV First Strand Buffer | 4 μl |
0.1 M DTT | 1 μl |
M-MLV GIII Reverse Transcriptase (200 U/μl) | 1 μl |
dNTP Mix (10 mM Each) | 1 μl |
（可选）RNase Inhibitor (40 U/μl) | 1 μl |
Nuclease-Free Water | To 2 0 μl |
a. 推荐使用试剂盒提取的已去除基因组DNA污染的高质量RNA作为模板。
2.轻柔吸打混匀后，瞬离；
3.若使用Oligo(dT)20 或基因特异性引物，50℃温育30 min；若使用随 机引物，先25℃温育5 min，之后50℃温育30 min；
注：若目的cDNA小于3 kb，温育时间可缩短为15 min。 4. 反应结束后，85℃温育5 min以终止反应；
5. 将获得的cDNA溶液置于冰上，用于后续实验。
注：cDNA溶液置于-20℃可保存半年；置于-80℃可长期储存。
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