货号：M5124
储存条件：-20℃
产品组成
组分规格 | 规格 |
M-MLVGIII Reverse Transcriptase(200U/ul) | 50ul |
5×M-MLV First Strand Buffer | 500ul |
0.1M DTT | 100ul |
产品简介
M-MLV GIII Reverse Transcriptase是通过基因修饰和重组技术获得的第三代M-MLV逆转录酶。该酶相对于野生型M-MLV逆转录酶去除了RNase H活性，并大幅提高了热稳定性（最适反应温度为50℃），从而大大提高了合成第一链cDNA时的特异性和长度（最长可达12 kb），增强了对RNA复杂二级结构的耐受性。
酶活单位定义
37℃条件下，以Poly(A)-Oligo(dT)为模板/引物，在10 min内， 掺入1 nmol的[3H] dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。
质量控制
宿主原性DNA检测
无宿主DNA污染
核酸内切酶残留检测
将酶液与超螺旋质粒DNA在37℃温育4h，通过DNA电泳检测质粒无变化。
核酸外切酶残留检测
将酶液与双链DNA底物在37℃温育16h，通过DNA电泳检测双链DNA底物无变化。
使用方法
质粒载体线性化与去磷酸化同步反应流程
1. 于冰上配制如下反应体系：
试剂 | 使用量 |
引物 | X ul |
Oligo(dT)20 | 终浓度2.5uM |
或随机引物 | 终浓度2.5ng/ul |
或基因特异性引物 | 终浓度0.25uM |
模板 RNAa | 50 ng~1ug/20ul |
5× M-MLV First Strand Buffer | 4ul |
0.1 M DTT | 1ul |
M-MLV GIII Reverse Transcriptase (200 U/ul) | 1ul |
dNTP Mix (10 mM Each) | 1ul |
（可选）RNase Inhibitor (40 U/ul) | 1ul |
Nuclease-Free Water | To 20ul |
2. 轻柔吸打混匀后，瞬离；a. 推荐使用试剂盒提取的已去除基因组DNA污染的高质量RNA作为模板。
3. 若使用Oligo(dT)20或基因特异性引物，50℃温育30 min；若使用随机引物，先25℃温育5 min，之后50℃温育30 min；
注：若目的cDNA小于3 kb，温育时间可缩短为15 min。
4. 反应结束后，85℃温育5 min 以终止反应；
5. 将获得的 cDNA 溶液置于冰上，用于后续实验。
注：cDNA 溶液置于 -20℃可保存半年；置于 -80℃可长期储存
| 使用量 |
引物 | X ul |
Oligo(dT)20 | 终浓度2.5uM |
或随机引物 | 终浓度2.5ng/ul |
或基因特异性引物 | 终浓度0.25uM |
模板 RNAa | 50 ng~1ug/20ul |
5× M-MLV First Strand Buffer | 4ul |
0.1 M DTT | 1ul |
M-MLV GIII Reverse Transcriptase (200 U/ul) | 1ul |
dNTP Mix (10 mM Each) | 1ul |
