产品货号 ：T0126

储存条件： -20℃ 保存，有效期2年

产品描述

产品简介

T7 High Yield RNA Synthesis Kit是一种使用T7 RNA聚合酶，以带有T7启动子的DNA为模板，通过体外转录大量合成RNA的试剂盒，适用于长链和短链转录本。本品提供的T7 Enzyme Mix中已经预混了RNase抑制剂与无机焦磷酸酶，而DNase I，RNase-free用于转录反应结束后清除模板DNA。使用本品以1μg线性化双链DNA模板可以转录获得至少150μg以上的RNA。通过转录合成的RNA可用于多种下游应用，如体外翻译、RNA结构和功能研究、RNase保护、探针杂交、RNA干扰等。

转录方案

使用方法

1. DNA 模板制备

带有 T7 启动子的线性化质粒或 PCR 扩增产物都可以作为体外转录模板，模板可以用TE缓冲液或Nuclease-Free Water溶解。

T7启动子序列：TAATACGACTCACTATAN*

注：N*为RNA转录的第一个碱基,一般为G，若进行共转录由帽子类似物决定。

（1）质粒模板

将目的DNA插入含有T7启动子的质粒载体中，然后用限制酶进行处理，待完全线性化后进行纯化。

注1：由于终止子不能保证转录100%终止，环状质粒会转录出不同长度的RNA产物。为了得到特定长度的RNA，质粒必须完全线性化。

注2：质粒线性化所选限制酶的酶切位点需要紧邻编码链下游，且在编码链中无识别位点。选择的限制酶要能形成5'突出末端或者平滑末端。

注3：为了避免蛋白及盐离子等对转录体系的影响，线性化质粒建议纯化后再作为模板进行体外转录。

注4：质粒DNA抽提过程中引入的RNaseA残留会显著影响转录RNA的质量，建议使用A260/A280为1.8~2.0的高纯度RNase-free模板。

（2）PCR 产物模板

带 T7 启动子的 PCR 产物可以作为体外转录模板。首先将 T7 启动 子序列加在编码链上游引物的 5' 端，然后在高保真酶的作用下扩增含 T7 启动子的 DNA模板，随后进行转录。 PCR 产物可以不经纯化直接作为模板， 但纯化后 RNA 收率会更高。

注 1：PCR 产物作为模板，必须电泳确认产物的特异性及浓度，建议 20 μl 反应体系投入 2~5 μl PCR 产物。

注 2：为了得到更多高品质的 RNA，推荐 PCR 产物纯化之后再作为模板进行体外转录。

2. 体外转录

（1）根据所需产物类型选择下面三个反应体系进行反应溶液加样。

①标准体外转录体系

在冰上配制如下反应体系：

a. 建议先加入Nuclease-Free Water, 然后再加入 ATP/CTP/GTP/UTP。

b. 可以用同样摩尔浓度的修饰 NTP 替代相应的未修饰 NTP。

②加帽 RNA 共转录体系     

在冰上配制如下反应体系：

c. 帽子类似物与每种 NTP 的摩尔浓度之比应为 4 : 5，该摩尔比适用于 CleanCap 系列帽子类似物。若使用其它结构的帽子类似物，请根据帽子类似物的说明书设定帽子类似物与 GTP 的合理比例，可根据加帽效率调整比例，但两者终浓度之和控制在 10 mM 为宜。

③非放射性标记 RNA 体外转录体系

d. 本体系适用生物素修饰 UTP、荧光素修饰 UTP、地高辛修饰 UTP 或者氨基烯丙 基修饰 UTP，使用修饰 UTP 转录产量会比未修饰 UTP 转录产量偏低。

注 1：不同模板序列的转录效率差异较大，初次实验可先按照建议加入量进行，然 后再摸索优化最适体系，模板量可在 0.5 μg~2 μg的范围进行调整。

（2）充分混匀并瞬离后，37℃温育 2 h。若转录产物长度 <100 nt，可 延长反应时间至 3~16 h。

（3）反应结束后，向产物中按照每 μg Template DNA 加入 2 μl DNase I, RNase-free 的比例，37℃孵育 15 min 以去除 DNA 模板。

（4）转录后的 RNA 推荐用磁珠或者柱纯化，也可以采用酚/氯仿或者氯化锂纯化。纯化后的 RNA 可以进行下游实验或者储存于 -80℃备用。

3. 对照模板转录（T 包装不含）

对照模板是一个含有T7启动子的线性 DNA 片段，转录产物大小 约 4000 nt。在推荐的标准体外转录反应体系中，1μg 对照模板 DNA 在 37℃下反应 2h至少可获得150μg以上的 RNA。

4. 产物纯化

转录后的 RNA 可以选用磁珠法进行纯化，也可以采用柱纯化、酚 / 氯仿纯化法或氯化锂沉淀法等，以去除蛋白、游离的核苷酸。纯化后的 RNA 经电泳检测后可进行下游实验或存储于 -80℃。

(1) 磁珠纯化法

按照磁珠说明书进行纯化操作。

(2) 柱纯化法

纯化前加入80μl Nuclease-Free Water 将产物稀释至 100 μl，再按纯化柱说明书进行纯化操作。

(3) 酚 / 氯仿纯化法

①向 20 μl 反应混合物中，加入 115 μl Nuclease-Free Water 和 15 μl 3 M 乙酸钠 (pH5.2)，混合均匀。

②加入等体积 (150 μl) 的酚 / 氯仿 (1：1) 混合液抽提一次，室温以最大转 速  (≥12000 rpm） 离心 5 min，将上层水相溶液转移至新的 RNase-free EP 管中。

注：转移上清时请勿吸到中间层。

③再加入等体积的氯仿抽提 2 次，收集上清，并转移至新的 RNase-free EP 管中。

④加入 2 倍体积的无水乙醇沉淀 RNA。混合均匀后置于 -20℃至少 30 min，以最大转速(≥12000 rpm），4℃离心 15 min，收集沉淀。

⑤加入 500 μl 冰预冷的 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀，以最大转速  (≥12000 rpm） ， 4℃离心 5 min ，收集沉淀。

⑥用 20 μl Nuclease-Free Water溶解RNA 沉淀。纯化后的 RNA 溶液于 -80℃保存。

(4) 氯化锂沉淀法

采用氯化锂沉淀法，RNA 长度至少满足 100 nt 以上，且浓度不能低 于 100 ng/μl。

①向 20 μl 反应混合物中，加入 30 μl Nuclease-Free Water 和 30 μl 7.5 M 氯化锂。

②混合均匀后，置于 -20℃至少 30 min，以最大转速 (≥12000 rpm），4℃ 离心 15 min，收集沉淀。

③加入 500 μl 冰预冷的 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀，以

最大转速  (≥12000 rpm），4℃离心 5 min，收集沉淀。

④用 20 μl Nuclease-Free Water 溶解 RNA 沉淀。纯化后的 RNA 溶液 于 -80℃保存。

5. RNA 定量

(1) 紫外吸收法：游离的 NTP 等会严重影响定量的准确性，采用此方法 前请先进行 RNA 纯化。

(2) 染料法：可使用 RNA 特异荧光染料或相关试剂盒进行 RNA 定量，可 以对纯化或者未纯化的反应产物中的 RNA 进行定量。

6. RNA 检测

(1) 凝胶电泳法

为了评估转录本的长度及质量，转录产物应选择合适的非变性或变 性琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测。变性电泳下可减少 RNA 的 二级结构形成 , 通常 RNA 以正确大小的单个条带迁移。

注 1：电泳缓冲液和凝胶均需现配现用，使用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时推荐 用 0.5× TBE（货号：T7272）电泳缓冲液电泳。

注 2：转录完成的 RNA 可用 Nuclease-Free Water 稀释后电泳，电泳上样量推荐 0.05~1 μg。

注 3：加完 RNA Loading Buffer 后的样品可于 65℃处理 5~10 min 以减少RNA二级结构形成。

注 4：可使用 Safe Red 核酸染料 ( 货号：CR001） 观察 RNA 电泳条带，聚丙烯 凝胶酰胺凝胶推荐用泡染法观察条带。

(2) 毛细管电泳法

毛细管电泳法可数字化的精确评估 RNA 样本的完整性、纯度或降解 程度。与凝胶法相比，此法所需 RNA 样本量低，灵敏度高。

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