产品货号：G1051P

产品说明

Glutathione Beads 4FF可以一步纯化各种表达系统表达的谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽依赖性蛋白和谷胱甘肽转移酶的重组衍生物。 Glutathione Beads 4FF是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，通过12个原子的间隔臂，用化学方法共价结合了还原型谷胱甘肽制作而 成。Glutathione Beads 4FF因其耐压的基质，可以在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化，更适合用于工业大规模蛋白的纯化。

表 1 Glutathione Beads 4FF 产品性能

 纯化流程

1. 缓冲液的准备

缓冲液在使用前最好用0.22um或者0.45um滤膜过滤。

平衡/洗杂液：140 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4

洗脱液：用平衡液配制10mM还原型谷胱甘肽（现配现用）

注意：平衡液和洗脱液中可加入1-10 mM DTT

2. 样品准备

样品在上样前建议离心或用0.22um或0.45um滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.1细菌或酵母表达的蛋白

1）挑取单菌落到培养基中，根据载体使用说明，加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。

2）表达结束后，将培养液转移到离心杯中，7000 rpm（7500xg）,离心15 min收集菌体，然后按照菌体：平衡液=1： 10（W/V）加入平衡液，加入终浓度为1 mM的PMSF。加入溶菌酶（工作浓度为0.2-0.4 mg/ml,如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶，同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与填料的结合）。

3）将菌体沉淀悬浮起来，（如果菌液浓度高，也可考虑加入10 ug/ml RNase A和5 ug/ml DNase I）,混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

4）将澄清的破碎液转移至离心管中，10000 rpm（15000xg）, 4°C离心20-30 min。取上清，置于冰上备用或-20°C保存。

2.2酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白

1） 将细胞培养液转移至离心杯，5000 rpm（3800xg）,离心10 min,收集菌体得上清，即可直接加入柱子使用。

2） 对于大量体积的上清，需加入硫酸铵沉淀浓缩后，蛋白还需用平衡液透析后才能加入柱子。

3. 重力柱的装填

1）取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。

2）将Glutathione Beads 4FF混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中（介质实际体积占悬液的一半），打开下出口流干保护液。

3）加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。

4）装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。

5）装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，2-8°C保存。

4.重力柱法纯化

1） 将装填好的Glutathione Beads 4FF重力柱用5倍柱体积平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下，重复2-3次。

2） 将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2 min,保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。

3） 用10-15倍柱体积的洗杂液进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4） 使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱，又可以得 到高纯度和高浓度的蛋白。

4.3中压层析柱法纯化

Glutathione Beads 4FF装填好后，可以用各种常规的中低压色谱系统。

1） 将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中，打开下出口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。

2） 用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。

3） 使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。

4） 利用泵或样品环上样。

注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。

5） 用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。

6） 使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

上述步骤洗脱结束后，用平衡液冲洗3倍柱体积，然后用纯水冲洗5倍柱体积，再用保护液冲洗2个柱体积，然后将介质置于2-8°C保存。

5. SDS-PAGE 检测

将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。

6. 填料清洗

GST标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量性能下降, 这时需要对填料进行清洗。

去除一些沉淀或变性物质，建议使用下面的方法：

用2倍柱体积的6 M盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS, pH 7.4清洗。

去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质：

用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton X-100清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS, pH 7.4清洗。