产品货号：M1050P

储存条件：2-8 °C 

产品简介

Dextrin Beads 6FF 是一种纯化带有麦芽糖结合蛋白(MBP）标签蛋白的亲和层析介质，具体性能见表1。MBP可促进连接蛋白的正确折叠，增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。Dextrin Beads 6FF可以一步纯化MBP融合蛋白，结合的融合蛋白可以用10 mM麦芽糖进行温和洗脱，保护了标签蛋白的活性。如果要去除MBP融合部分可用位点特异性蛋白酶切除。

表 1 Dextrin Beads 6FF 产品性能

纯化流程

1. 缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22 um或0.45 um滤膜过滤。

平衡/洗杂液: 20 mM Tris-HCI，200 mM NaCl，1 mM EDTA，pH7.4

洗脱液: 20 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，10 mM麦芽糖，pH7.4

注意: 平衡液和洗脱液中可加入1 mM DTT或10 mM β-疏基乙醇

 2. 样品准备

样品在上样前建议离心或用0.22um或0.45um滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

 3 Dextrin Beads 6FF装填

3.1重力柱的装填

1）取合适规格的重力层析柱，装入下垫片，加入适量纯水润洗柱管和垫片，关闭下出口。

2）将Dextrin Beads 6FF混合均匀，用枪头吸取适量浆液加入至重力柱中(介质实际体积占悬液的一半)，打开下出口流干保护液。

3）加入适量纯水冲洗介质，待柱管中液体重力流干后，关闭下出口。

4）装入润洗后的上垫片，确保垫片与填料之前没有空隙，且保持水平。

5）装填好的重力柱可以直接加入平衡液进行平衡，暂不使用时则加入保护液，2-8℃保存。

3.2中压层析柱的装填

Dextrin Beads 6FF被广泛应用于工业纯化，因此，涉及到各种中压色谱层析柱的填装，下面介绍填装层析柱的方法。装柱前根据层析柱直径计算柱子底面积，根据所需装柱高度计算所需介质体积，公式如下:

V = 1.15πr²h  (V：所需介质体积ml；1.15：压缩系数；r：柱管半径cm；h：装填高度cm）

注意：所取悬液体积应为介质体积的两倍，因为介质体积只占悬液总体积的一半，另一半为保护液。

1） 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留1-2 cm的去离子水。

2） 将介质悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。

3） 如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。

4） 打开层析柱底部出口，开启泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，这样可避免液压对所形成柱床的冲击，也可以避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用所使用泵的最大流速，这样也可以得到一个很好的装填效果。（注意：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%）当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。

5） 关闭泵，关闭层析柱出口。

6） 如果使用储液器，去除储液器，将分配器置于层析柱中。

7） 将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。

8） 将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

 4. 样品纯化流程

4.1孵育法纯化

1） 根据纯化样品量，取适量Dextrin Beads 6FF加入离心管中，1000rpm离心1 min,吸弃上清；也可加入重力柱中，流干保护液。

2） 向离心管中加入5倍介质体积的平衡液清洗介质，1000rpm离心1 min,吸弃上清；如使用重力柱，则直接在重力柱中清洗，直接重力流干平衡液；重复两次以上。

3） 加入样品，封闭离心管或重力柱管，4°C振荡孵育2-4h或者37°C孵育30 min-2h。

4） 孵育结束后，1000 rpm离心1 min,吸弃上清，或过滤收集介质，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。

5） 用5倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000 rpm离心1 min或重力柱管过滤，去除上清（注意不要吸到介质），重复3-5次，中间建议更换新离心管。

6） 加入3-5倍柱体积的洗脱液进行洗脱，室温孵育10-15 min, 1000 rpm离心1 min或重力柱管收集洗脱液，可重复2-3次。

4.2重力柱法纯化

1） 将装填好的Dextrin Beads 6FF重力柱用5倍柱体积平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲液体系下，重复2-3次。

2） 将样品加到平衡好的重力柱中，样品保留时间至少2 min,保证样品和介质充分接触，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。

3） 用10-15倍柱体积的洗杂液进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4） 使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，分段收集，每一个柱体积收集一管，分别检测，既可以保证所有

结合的目的蛋白被洗脱，又可以得 到高纯度和高浓度的蛋白。

4.3中压层析柱法纯化

Dextrin Beads 6FF装填好后，可以用各种常规的中低压色谱系统。

1） 将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中，打开下出口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。

2） 用3-5倍柱体积的去离子水冲洗出储存缓冲液。

3） 使用至少5倍柱床体积的平衡液平衡色谱柱。

4） 利用泵或样品环上样。

注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少，也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。

5） 用洗杂液冲洗柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。

6） 使用5-10倍柱体积的洗脱液洗脱，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

上述步骤洗脱结束后，用平衡液冲洗3倍柱体积，然后用纯水冲洗5倍柱体积，再用保护液冲洗2个柱体积，然后将介质置于2-8°C保存。

5. SDS-PAGE 检测

将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。

6. 填料清洗

Dextrin Beads 6FF纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异性结合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降，这时可按照下面方法对填料进行清洗。

1）3倍柱体积的去离子水;

2）3倍柱体积的0.1% SDS或0.1 M NaOH溶液;

3）3倍柱体积去离子水，20%乙醇2-8℃保存。