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【干货分享】Western实验步骤及产品选择
来源: | 作者:LABLEAD | 发布时间: 2023-12-19 | 246 次浏览 | 分享到:

Western blot,也称Western blotting、Western印迹,常简写为WB,是用抗体检测蛋白表达的重要方法之一。WB步骤操作如下:


一、 蛋白样品处理

1、裂解液的选择

根据蛋白在细胞中的位置选择合适的裂解液,例如RIPA强(R1091)用于核蛋白及膜蛋白的提取、RIPA中(R1090)用于胞浆蛋白的提取、而RIPA弱或者western专用裂解液(W0013)适用于较好提取的蛋白;

对于某些特定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒进行抽提

2、抑制蛋白降解

为防止蛋白的降解,需要添加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等。例如LABLEAD的蛋白酶抑制剂cocktail(C0101)是一种广谱型的抑制剂,由六种成分配置成的溶液,可适用于蛋白纯化,western,IP等各种实验。

如研究磷酸化蛋白,为保持蛋白的稳定,可使用磷酸蛋白酶酶抑制剂(C0104)。

3、蛋白定量:

收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

如果使用LABLEAD的裂解液(R1091R1090W0013),可使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(B5001)、Bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型)(B5106)

如自己配置裂解液,其中含有triton x-100、SDS等去污剂时,推荐使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(B5001);如溶液中含有EDTA、DTT等还原剂时推荐使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(B5105

 

二、电泳

1、SDS-PAGE凝胶配制

SDS-PAGE凝胶分几种配置的方式,如需自行配置可购买制胶液,如30%制胶液(A3291)、4*SDS浓缩胶缓冲液(S4880)、4*SDS分离胶缓冲液(S4680),也可使用LABLEAD生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P1050M)、SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(P0105)。两种试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。

如需更方便的电泳,可使用LABLEAD的各种浓度规格的预制胶产品(P00812/P00815/P01012/P01015/P01212/P01215/P41212/P41215/P42012/P42015)

2、样品处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如4X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制,推荐LABLEAD的蛋白上样缓冲液(4X)(G2526) 蛋白上样缓冲液(5X) (G2527)

如果是非变性样品,可以使用非变性非还原性蛋白上样缓冲液(G2621)

样品处理时可按照100℃或沸水浴加热3-5min,或者95℃ 加热10min,以充分变性蛋白。如使用预制胶,可适当延长样品处理的时间。

3、上样与电泳

蛋白样品冷却到室温后,直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。

LABLEAD提供各种预染蛋白质分子量标准用于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小。最好使用彩色预染蛋白质分子量标准(P1017/P1018/P1025/P10310)。

电泳液推荐使用兰博利德生产的SDS-PAGE电泳液(T7777),或者可以长期储存的速溶颗粒产品(T7206M)。

电泳时推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,当溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求。为了方便起见,也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式,通常把电压设置在100V,然后设定定时时间为90-120分钟。设置定时可避免发生电泳过头的情况。

当溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或可根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

 

三、 转膜(Transfer)

推荐在Western实验中选用PVDF膜,优先推荐使用PVDF膜,如蛋白分子量大于20KD推荐使用(进口分装,13.25*15cm,0.45μm) (IPVH00010-1),蛋白分子量小于20KD推荐使用(进口分装,13.25*15cm,0.45μm) (ISEQ00010-1)。PVDF膜在使用前须经甲醇浸润和活化。也可使用硝酸纤维素膜(NC膜),但硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。

转膜推荐使用bio-rad的预裁转印滤纸(7.5×250px) (cat:1703932),吸水性强,不掉屑。

转膜溶液推荐使用LABLEAD的10X转膜缓冲液(T3011),需要在稀释是添加20%的甲醇,以提高转膜效率。出于安全性、省事性的考虑LABLEAD还有使用乙醇配置的转膜缓冲液,20x快速转膜缓冲液(T3012

通常湿式转膜方式,可以设定转膜电流为300-400mA,转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。

如使用伯乐的Turbo系统进行半干转时,在使用伯乐配套的转膜缓冲液()时,则可参考以下转膜条件:2.5A恒流,限压25V,3-5min即可完成转膜。

在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

转膜的效果可参考所使用的预染蛋白质分子量标准,其中分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色,用于观察实际的转膜效果。也可用免脱色考马斯亮蓝快速染色液(G1042)对完成转膜的蛋白胶进行染色,用于检测转膜的效果。

 

四、封闭(Blocking)

转膜结束后,将蛋白膜放置到预先加入了清水的孵育盒(FYH01-1)中,漂洗1-2分钟,洗去膜上的转膜液。转膜结束后的所有步骤,要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则很容易产生较高的背景。

倒掉洗膜后的液体,推荐加入适量的快速封闭液(P0203),在摇床上缓慢摇动,室温封闭20-30分钟;也可以加入用脱脂奶粉(N7861)配置的5%的溶液作为封闭液,在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟或者4度过夜。对于一些背景较高的抗体,两种封闭液都可以适当延长封闭时间,如有必要甚至可以4℃封闭过夜。

 

五、一抗孵育

参考一抗的说明书,按照适当比例用一抗稀释液(D0151)稀释一抗。一抗也可以用TBST溶液或者配置好的封闭液稀释,但是为了延长一抗的使用时间,推荐用一抗稀释液。

收集封闭液,然后加入稀释好的一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳,可以4℃缓慢摇动孵育过夜。也可根据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。

回收一抗。加入TBST缓冲液(T9039)洗去未结合的一抗,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

Western结果通常需要提供内参作为对照,可以选用Tubulin抗体(T0100)、Actin抗体(A0101)或GAPDH抗体(G0100),进行内参检测。

 

六、二抗孵育

参考二抗的说明书选择辣根过氧化物酶(HRP)等标记的二抗。二抗需根据一抗进行选择,例如,一抗是小鼠来源的IgG,则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗,如山羊抗小鼠IgG-HRP(H+L)(S0100)

加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

回收二抗,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟,重复洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

 

七、显影检测

使用LABLEAD ECL发光液来检测蛋白,ECL发光液 普通款(E1050)一般使用暗室曝光时可推荐此款。如需更灵敏的发光液,推荐使用 ECL 超敏发光液(E1060),和ECL 超敏发光液M(E1070,和millipore WBKLS0100同级别);如蛋白丰度极低时推荐使用 ECL超敏发光液(femto)(E1080)

 

八、膜的重复利用

如果蛋白样品很宝贵,可使用膜再生液(M0500)处理蛋白膜,以重复利用蛋白膜。再次重生使用的膜需要重新封闭后孵育新的二抗。